Туберкулез :

Навигация :

Обратная связь :

Определение лекарственной чувствительности выделенных штаммов микобактерий

При лабораторной диагностике туберкулеза недостаточно дать ответ, констатирующий, обнаружены или нет тем или иным методом микобактерий туберкулеза. Для клиники туберкулеза, детального представления о характере микобактериальной популяции и определения прогноза заболевания необходимо изучение различных свойств культур, выделенных от больного: лекарственной чувствительности, ферментативной активности, вирулентности, видовой принадлежности. В некоторых случаях необходимо дифференцировать выделенные культуры и установить характер атипичных культур. Все это обусловливает то разнообразие исследований, которые необходимо проводить при лабораторной диагностике туберкулеза.

Определение лекарственной чувствительности выделенных штаммов микобактерий является необходимым и весьма важным этапом микробиологических исследований. Развитие лекарственной устойчивости обусловлено многими факторами: селекцией устойчивых вариантов в микобактериальной популяции, вегетирующей в организме больного; индукцией противотуберкулезными препаратами или антибиотиками, применяемыми в процессе химиотерапии; передачей эписомного R-фактора чувствительным особям (нехромосомная устойчивость) и др. Следует отметить, что снижение чувствительности микобактерий туберкулеза отмечается ко всем противотуберкулезным препаратам, однако оно может отличаться по степени, характеру, частоте и скорости появления. Известно, что из патологического материала от больных туберкулезом выделяются неоднородные по лекарственной чувствительности микобактерий: устойчивые к одному лекарственному препарату, или моноустойчивые, варианты с истинной двойной или полиустойчивостью, а также смесь вариантов, устойчивых к различным препаратам.

Определение спектра и степени чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам имеет важное значение для тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения и определения прогноза заболевания. Степень лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза определяется в соответствии с установленными критериями, которые зависят как от противотуберкулезной активности лекарственного препарата, так и его концентрации в очаге поражения, величины максимальной терапевтической дозы, фармакокинетики препарата и др.

Определение лекарственной чувствительности в настоящее время проводится бактериологическими методами — методом разведений на плотной питательной среде и методом разведений (или абсолютных концентраций) на жидких питательных средах. Имеется много модификаций обоих методов. В качестве унифицированного в России применяют рекомендованный Комитетом по химиотерапии ВОЗ метод определения лекарственной чувствительности микобактерий на плотной среде Левенштейна — Йенсена (без крахмала), в которую перед свертыванием добавляют различные концентрации препаратов. Минимальный набор состоит из 2—3 пробирок с разными концентрациями каждого из используемых в данной клинике препаратов, одной контрольной пробирки со средой без препарата.

Этот метод достаточно точен. Он позволяет применять патологический материал, содержащий любое количество микобактерий, поскольку для определения лекарственной чувствительности используются микобактерий, предварительно выделенные из патологического материала. Поскольку сроки выделения возбудителя на питательных средах составляют не менее 1—1,5 мес, результаты определения лекарственной чувствительности указанным методом можно получить не ранее чем через 2—2,5 мес после забора материала. В этом заключается один из основных недостатков метода. Описанный метод определения лекарственной чувствительности микобактерий после выделения их чистой культуры получил название непрямого метода.

При массивном бактериовыделении (не менее 1—5 микобактерий в каждом поле зрения) применяют прямое определение лекарственной чувствительности при выделении возбудителя непосредственно из патологического материала. Для этого используют метод глубинного посева и метод культивирования на стеклах в жидких питательных средах. Эти методы более трудоемки, требуют дополнительного приготовления мазков, окраски и микроскопирования последних и, кроме того, менее точны, так как невозможно дозировать засев микобактерий. Однако результаты можно получить в более короткие сроки (через 12 дней). Практикуется также прямое определение лекарственной устойчивости на плотных средах, в этом случае результаты можно получить через 3 нед.

Лекарственно-чувствительные штаммы дают рост на средах с препаратами в пределах определенной концентрации, различной для каждого препарата. Штаммы, которые растут при соответственно более высоком содержании этих препаратов в питательной среде, относят к лекарственно-устойчивым. Устойчивость определяют по наличию макроскопически видимого роста на плотных и микроскопического роста — на жидких средах.

Устойчивость данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество микрограмм в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение микобактерий (по числу макроколоний при посеве на плотные среды и микроколоний при посеве на жидкие среды). Лекарственно-устойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное воздействие. При определении лекарственной устойчивости микобактерий на плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20. Только при наличии более 20 колоний культура расценивается как устойчивая.

Для различных препаратов установлена определенная предельная концентрация, при которой еще наблюдается размножение чувствительных к этому препарату микобактерий. Границей, или критерием устойчивости, называют те первые концентрации препарата в питательной среде, выраженные в микрограммах на 1 мл, при которых начинают размножаться устойчивые особи. Для плотной среды Левенштейна — Йенсена установлены следующие концентрации (мкг/мл): стрептомицин — 5; изониазид — 1; этионамид — 30; протионамид — 30; циклосерин — 50; канамицин — 30; фло-римицин (виомицин) — 30; тиоацетазон (тибон) — 2; этамбутол — 2; рифампицин — 20.

Наряду с анализом лекарственной чувствительности все выделенные при посеве медленно растущие штаммы микобактерий подлежат первичной идентификации для определения их видовой принадлежности <М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum, М. microti), так как принадлежность возбудителя к тому или иному виду существенно влияет на тактику химиотерапии, прогноз заболевания и др. Одним из основных лабораторных тестов, позволяющих дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis и микобактерии всех других видов, служит ниациновый тест. Он основан на уникальной способности микобактерии человеческого типа синтезировать ниацин (никотиновую кислоту) в значительно больших количествах, чем микобактерии бычьего типа и нетуберкулезные микобактерии.

В случае выделения нетуберкулезных (атипичных) микобактерии, как медленно, так и быстро растущих, необходимо прежде всего правильно оценить их роль в заболевании, а затем идентифицировать их. Для установления диагноза микобактериоза надо многократно повторно выделить один и тот же вид микобактерии. Все туберкулезные микобактерии подлежат специальному изучению с помощью бактериологических и биохимических методов идентификации. Порядок и основные методы идентификации определены приказом МЗ СССР № 558 от 8 июня 1978 г. «Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе», а также изложены в методических рекомендациях «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерии» (Л., 1980).

Биологическая проба. При отрицательных результатах бактериоскопии и посева материала, исследуемого на микобактерии туберкулеза, если все же подозревается туберкулез, ставят опыты на животных (так называемая биологическая проба). Это наиболее чувствительный метод выявления возбудителя туберкулеза. Самым чувствительным к туберкулезной инфекции лабораторным животным является морская свинка. Считается, что заражение морской свинки позволяет диагностировать туберкулез даже при наличии в материале, использованном для заражения, 1—5 микробных клеток.

Биологический метод широко применяется в диагностике туберкулеза со времени открытия возбудителя этой инфекции. Он не потерял своей ценности и в настоящее время. Более того, сейчас этот метод с успехом применяется для выявления не только типичных неизмененных, но и разнообразных биологически измененных форм возбудителя, в частности L-трансформированных и фильтрующихся форм. Кроме того, этот метод является основным при определении видовой принадлежности микобактерии, их вирулентности, изучении патогенности атипичных культур. Он широко используется для воспроизведения туберкулеза отдельных органов, исследования аллергических реакций, иммунитета и эффективности химиотерапии при туберкулезе. В последние годы метод применяется при проведении биологических пассажей в процессе изучения биологически измененных форм возбудителя в целях получения биологической реверсии.

При любом методе заражения морских свинок микобактериями туберкулеза у животных развивается генерализованный туберкулезный процесс, заканчивающийся гибелью. Однако следует иметь в виду, что возбудители туберкулеза, устойчивые к препаратам изоникотиновой кислоты, вследствие снижения или потери вирулентности могут не вызывать заболевание у морских свинок и дать отрицательные результаты биологической пробы при одновременном наличии роста на питательных средах при посеве. Это обстоятельство диктует необходимость дифференцированного подхода к результатам биологической пробы и одновременного использования метода посева при проведении заражения животного в диагностических целях.

Для повышения частоты обнаружения микобактерий туберкулеза в патологическом материале многие авторы используют, помимо подкожного, интратестикулярное заражение. При этом в патологическом материале удается чаще выявлять изониазидоустойчивые слабовирулентные микобактерий. Кроме того, для повышения чувствительности биологического метода рекомендуется искусственно снижать естественную резистентность морских свинок ежедневным введением больших доз кортизона (12,5 мг), что позволяет повысить результативность биологической пробы на 15—29% (по данным разных исследователей). Наконец, результативность биологической пробы можно повысить, применяя метод последовательных биологических пассажей. Для этого заражение каждой последующей морской свинки производится гомогенатом органов от предыдущего животного, использованного в биологической пробе. По мере увеличения числа пассажей нарастает выраженность специфических изменений в органах.

Следует подчеркнуть, что особую ценность биологическая проба представляет для диагностического исследования олигобациллярного материала.

Перед заражением морским свинкам с массой 200—250 г ставят реакцию Манту, вводя 0,02 мл альттуберкулина Коха внутрикожно в наружную поверхность бедра, освобожденную от волосяного покрова; контроль — введение такого же количества бульона в другую лапку. При отрицательной реакции через 48 ч свинку можно брать в опыт. Для заражения в диагностических целях можно использовать различный патологический материал: мокроту, мочу, промывные воды, отделяемое ран и др. Исследуемый материал обычно обрабатывают 3% раствором серной кислоты так же, как и для посева. Затем осадок 2 или (лучше) 3 раза отмывают стерильным изотоническим раствором NaCl и центрифугируют. Такое отмывание является обязательной процедурой, поскольку при попадании кислоты животному под кожу может развиться некроз. К отмытому осадку добавляют изотонический раствор NaCl и вводят эту смесь под кожу правой паховой области. За свинками проводят систематическое наблюдение, проверяя появление местного инфильтрата в месте введения материала, изъязвление этого инфильтрата, состояние регионарных лимфатических узлов и места введения материала; повторно ставят реакцию Манту. То же повторяют через 6 нед и далее. При положительных туберкулиновых пробах и наличии местных изменений свинок забивают через 1—1,5 мес, при отсутствии признаков развивающегося туберкулеза — через 3 мес.

Туберкулиновые пробы при наличии туберкулезного процесса становятся положительными через 2 нед — 1 мес после заражения.

На вскрытии свинок, погибших от туберкулеза, наблюдается картина генерализованного туберкулеза. Если при заражении в материале были слабовирулентные микобактерии туберкулеза, то развитие процесса может ограничиться увеличением лимфатических узлов и единичными очажками в органах. Во время вскрытия делают мазки-отпечатки из органов для бактериоскопических исследований. Кроме того, кусочки лимфатических узлов, селезенки, печени и легких вырезают стерильным инструментом, помещают в стерильную ступку, гомогенизируют и засевают на плотные питательные среды. Посевы производят обязательно при отсутствии в органах макроскопически видимых изменений туберкулезного характера. Кроме того, в сомнительных случаях проводят гистологическое исследование тканей.

Для оценки распространенности и характера туберкулезного поражения у морских свинок предложено несколько схем учета макроскопических изменений в органах. Наибольшее распространение в нашей стране получили схемы, разработанные М. В. Триус и Ю. К. Вейсфейлером. По этим схемам специфические изменения в органах и лимфатических узлах оцениваются в зависимости от степени их выраженности плюсами, которые затем переводятся в цифровые показатели.

Микробиологическая диагностика b-трансформированных и фильтрующихся вариантов микобактерии. Все изложенное выше касается разнообразных методов выявления и идентификации классических бактериальных форм возбудителя туберкулеза, не учитывая многообразные формы, возникшие в результате морфологической, тинкториальной и биологической изменчивости микобактерии.

В настоящее время традиционные методы выделения микобактерии туберкулеза все меньше удовлетворяют нужды клиники, так как информативность микробиологических исследований явно недостаточна. Применяемые методы малоэффективны и не позволяют составить представление об истинном состоянии микобактериальной популяции, вегетирующей в организме больного. Это объясняется, с одной стороны, недостаточной чувствительностью ряда методов, а с другой (в значительно большей степени), тем, что большинство таких методов не позволяет выявить возбудитель, находящийся в b-трансформированном состоянии.

Разделы

Быстрый доступ :

Главная Закладки Контакт
Главная Закладки Контакты

Популярные статьи :


Поиск :


Закладки

ОднаКнопка

Курсы валют :

USA ЦБ 23.5125 0.1366

EUR ЦБ 36.9381 -0.1688


Наши друзья :

Copyright © Туберкулез. Борьба с туберкулезом