Туберкулез :

Навигация :

Обратная связь :

Приготовление мазков для бактериоскопического исследования

Приготовление мазков для бактериоскопического исследования является весьма ответственной процедурой, во многом предопределяющей успех исследования. При этом необходимо иметь в виду, что это одна из самых опасных процедур. Туберкулез распространяется воздушно-капельным путем через мельчайшие капельки размером около 5 мкм, содержащие возбудитель, которые при вдыхании в легких могут достигать альвеол и оседать в них, формируя очаг инфекции. В лабораторной работе усилия должны быть направлены на то, чтобы избежать или свести к минимуму опасность заражения при тех манипуляциях, при выполнении которых наблюдается наибольшая опасность рассеивания потенциально инфекционных аэрозолей. Основными источниками образования таких аэрозолей в лабораториях являются манипуляции, которые связаны с приготовлением мазков для бактериоскопии: 1) открывание контейнеров с материалом; эта манипуляция особенно опасна, если между наружной стенкой горлышка контейнера и внутренней поверхностью крышки находятся частицы высохшей мокроты или если непосредственно перед открыванием контейнер подвергался встряхиванию; 2) приготовление мазков путем нанесения материала на предметное стекло и распределение его по поверхности стекла; 3) прожигание бактериологических петель, используемых для переноса материала на стекло. При выполнении этих манипуляций следует соблюдать особую осторожность.

Мазки для бактериоскопического исследования готовят из нативной необработанной мокроты. Для этого мокроту переливают в чашку Петри, под дно которой подложена черная бумага. Рядом с чашкой помещают два чистых (ранее не бывших в употреблении) и заранее промаркированных предметных стекла. С помощью двух препаровальных игл, бактериологических петель или хорошо заостренных деревянных палочек (для каждой пробы мокроты новых) выбирают 5—6 наиболее плотных гнойных комочков мокроты, переносят их на стекло, покрывают сверху вторым стеклом, слегка придавливают и, раздвигая стекла в разные стороны, растирают до получения равномерного тонкого слоя. Мазок должен занимать 2/з— 3Л стекла.

Во время приготовления мазков следует соблюдать максимальную осторожность, чтобы избежать образования брызг и выхода материала за края стекла.

Приготовленные мазки помещают на 15—30 мин на фильтровальную бумагу для просушки при комнатной температуре. Поскольку не всегда удается избежать попадания материала на края стекла, то бумагу, на которой для просушки раскладывают мазки, следует считать зараженной. Высохшие стекла пинцетом или специальными щипцами берут за конец, на котором нанесена маркировка, и 3 раза проводят через пламя спиртовки или газовой горелки (общая продолжительность пребывания мазка в пламени не должна превышать 3—5 с), а затем помещают на чистую бумагу или специальный поднос.

Целесообразным и в плане охраны труда, особенно рекомендуемым является метод, предложенный Hain. Предметные стекла с мазками, расположенные на жестяных подносах, помещают в стерилизатор и прежде всего высушивают при 37°С. Затем температуру повышают до 105°С и спустя 10 мин стерилизатор выключают. Этим достигаются надежное прикрепление мазка к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале и по краям стекол, так и попавших на поднос. Температура не должна превышать 105°С, чтобы не изменить тинкториальные свойства микобактерий.

В целях большей безопасности мазки из мокроты можно делать из осадка после обработки материала.

Мазки из жидкого патологического материала (бронхоальвеолярные смывы, промывные воды бронхов или желудка, моча, пунктаты из закрытых полостей, экссудаты и др.) готовят из осадка материала, полученного после обработки его кислотой или щелочью с последующим отмыванием либо нейтрализацией и центрифугированием. Высушенные и фиксированные мазки окрашивают. При выборе окраски учитывают метод микроскопии, с помощью которого будет осуществляться бактериоскопическое исследование: обычный световой (масляная иммерсия) или люминесцентный (флюоресцентная микроскопия) микроскоп.

Наиболее употребляемым и распространенным методом окраски для выявления кислотоустойчивых микобактерий является способ Циля — Нильсена. При одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего вещества фенола (карболовой кислоты), на котором готовится основное красящее вещество фуксин, облегчается проникновение анилинового красителя в микробную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки, состоящей из липидов и миколовых кислот. Обычные анилиновые красители не воспринимаются микобактериями, и последние не окрашиваются. Последующее обесцвечивание мазка в 29% растворе серной кислоты или 3% растворе солянокислого спирта приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Только микобактерий, обладающие выраженной кислото- и спиртоустойчивостью, стойко удерживают краситель и остаются окрашенными в красный цвет. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают метиленовым синим. Микобактерий обнаруживаются в препарате в виде тонких, прямых или слегка изогнутых ярко-красных палочек, иногда расположенных под углом в виде римской цифры V, часто кучками или небольшими скоплениями. Нередко в теле палочек или отдельно от них выделяются единичные более темные зерна или их скопления (зернистые формы).

При микроскопии мазков следует учитывать широкий полиморфизм микобактерий туберкулеза, особенно при исследовании материала от больных, получающих противотуберкулезные препараты. В связи с тем что широкое применение химиопрепаратов меняет морфологию микобактерий, в ряде случаев при исследовании препаратов могут обнаруживаться и ветвистые формы неравномерной ширины, и бледноокрашенные палочки, и осколки микобактерий, и отдельные кислотоустойчивые зерна или их скопления.

Кроме того, в мазках из осадка мочи, промывных вод желудка и другого материала наряду с микобактериями туберкулеза могут обнаруживаться и кислотоустойчивые сапрофиты, в частности в моче — микобактерий спермы, которые легко спутать с микобактериями туберкулеза. В сомнительных случаях рекомендуется мазок длительно (45—60 мин) обесцвечивать в солянокислом спирте или жавеловой воде. При таком методе обесцвечивания сапрофиты теряют свою окраску и выгладят в виде палочек голубого цвета (в результате докрашивания мазка после обесцвечивания метиленовым синим).

Правильная микроскопия препаратов является ответственной процедурой и требует высокой квалификации и большого опыта микроскописта, так как на основании результатов микроскопии ставится диагноз, уточняются эффективность лечения и прогноз заболевания.

Микроскопию окрашенных препаратов производят в световом микроскопе с иммерсионным объективом х°0 и окуляром *10 (увеличение *900). Желательно использовать бинокулярный микроскоп с объективом *100. На просмотр обычно требуется в среднем около 5 мин. Этого времени достаточно, чтобы просмотреть не менее 100 полей зрения и обнаружить единичные микобактерии. Согласно рекомендациям Международного союза по борьбе с туберкулезом (1976), просмотр препарата следует начинать в центральной части левого края мазка, постепенно передвигаясь вправо вдоль длинной оси мазка. Подсчитано, что просмотрев последовательно в этом направлении 100 полей зрения, микроскопист продвинется на 2 см. В некоторых случаях бактериоскопическое исследование 100 полей зрения оказывается недостаточным (см. ниже) для обоснованного заключения о количестве возбудителей, выделяемых больным. В таких случаях рекомендуется исследовать не менее 300 полей зрения по схеме, приведенной на рис. 4.1.

В последние годы довольно широкое распространение получил метод люминесцентной микроскопии. Он основан на различии свечения микроскопируемого объекта в ультрафиолетовом или коротковолновом спектре видимого света. В основе применения этого метода для дифференциации микобактерии туберкулеза лежит способность липидов этих бактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от применяемых красителей микобактерии туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое — на темно-зеленом фоне. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в которой могут быть сапрофиты, трудно дифференцируемые при такой окраске. Последние имеют зеленоватый или апельсиновый оттенок. Наиболее широко распространены методы окраски акридиновым оранжевым по Адамчику и окраски аурамином-родамином.

При микроскопии мазков по люминесцентному методу высокая контрастность микроскопической картины дает возможность проводить исследования при малых увеличениях (объектив х40, окуляр х10). При такой микроскопической системе увеличивается одномоментно просматриваемое поле зрения (по сравнению с иммерсионной микроскопией). Это позволяет выявлять единичные микобактерии и делает люминесцентный метод особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала. Люминесцентная микроскопия значительно сокращает время, затрачиваемое на нахождение единичных микобактерии туберкулеза, позволяет быстро просмотреть весь препарат и, следовательно, повысить число находок.

Быстрый доступ :

Главная Закладки Контакт
Главная Закладки Контакты

Популярные статьи :


Поиск :


Закладки

ОднаКнопка

Курсы валют :

USA ЦБ 23.5125 0.1366

EUR ЦБ 36.9381 -0.1688


Наши друзья :

Copyright © Туберкулез. Борьба с туберкулезом